Храни Безплатни пълнотекстови извънклетъчни протеини на хема Влияят на разпространението на миосателитни клетъчни клетки от говеда
Двуизмерно имунофлуоресцентно оцветяване на изолирани сателитни клетки от говежди мускули (BSC). (А) Размножаващ се говежди сателит, оцветен за DAPI, актинов цитоскелет (Phalloidin) и Pax7, ядрен маркер на сателитни клетки. Петната показват много чиста популация на сателитни клетки, следвайки протокола за изолиране и предварително покритие. (B) След една седмица на диференциация, клетките бяха оцветени за DAPI, актинов цитоскелет (Phalloidin) и Troponin T (CT3), маркер на миогенезата. Скалите са 200 µm.
Разпространение на BSC, отглеждани в присъствието на различни концентрации на Hb или Mb в 2D. (А) Клетъчен брой на BSC, BSC + 3 mg/mL Hb или BSC + 3 mg/mL Mb, количествено измерен с реагент CyQuant (n = 6) след един, три, пет и седем дни. Наблюдава се пролиферация на BSC с различни концентрации на (B) Hb и (C) Mb, при 1, 3 или 5 mg/ml (n = 6). Броят на клетките се изчислява от стандартна крива, приготвена от клетки, засети с известна плътност. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001.
Свойства на образуването на скелетна мускулна тъкан. (А) Представителни изображения на биоизкуствени мускули (BAMs), генерирани от BSCs, BSCs + Hb и BSCs + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина) в различни времеви точки (един, четири, седем и девет дни инкубация), показващ увеличена интензивност на цветовете в конструкции с Hb и Mb. Скалата е 10 мм. (B) Представени са теглото, ширината и дебелината на BAM в момента на прибиране на реколтата. Групите бяха сравнени с групи без добавен ACA (–ACA) и фибринов гел без добавени клетки, и двете инкубирани за еднакво време, при същите условия, за сравнение на уплътняването на хидрогел от клетките. Широчината и дебелината могат да бъдат измерени само в + ACA BAMs, тъй като –ACA BAM се откъсват от опорни точки и губят физическата си форма. (C) ДНК на BSCs, BSCs + Mb (n = 5) и BSCs + Hb (n = 4) беше извлечена чрез разграждане на протеиназа К и абсорбцията беше измерена с NanoDrop.
Конфокално имунофлуоресцентно изображение на BAM. BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml и за двата хем протеина), бяха оцветени след осемдневна диференциация за DAPI, актинов цитоскелет (фалоидин) и тропонин Т (CT3), маркер на миогенезата . Изображенията показват многоядрено образуване на миотръби в BSC и BSC + Mb конструкции, макар и не в BSC + Hb конструкции. Скалите са 200 µm.
Живо мъртво оцветяване на мускулни конструкции. BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина), бяха оцветени с калцеин АМ (живи клетки, зелено) и етидиев хомодимер (мъртви клетки, червено), за да се наблюдава цялостната жизнеспособност на клетките. Изображенията са направени в зелен канал (488 nm) и червен канал (594 nm), при идентични условия на микроскоп, с z-Stack. За визуализиране на цялостната жизнеспособност на клетките в цялостната конструкция е извършено x-y-шевове. Мащабната лента в едноканални изображения е 200 µm, а мащабната лента в общата конструкция е 1000 µm.
Подравняване на BSC. (A) BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина), бяха оцветени с калцеин АМ и изобразени с флуоресцентен микроскоп, след което изображенията бяха обработени на Фиджи с инструмента за насочване ( Метод на Фурие). Изравняването на клетките беше определено като процент на структурите, които бяха подравнени между -10 ° и 10 ° по отношение на оста на подравняване (0 °). Статистическата значимост беше определена чрез еднопосочен ANOVA и множество сравнения post hoc на Tukey (α = 0,05). Лентите за грешки са стандартни отклонения (n = 9). (B) Средната ориентация на миотръбите на контролната група (BSC) е визуализирана чрез представителен график за роза MatLab. *** p ≤ 0,001.
Сканиращи изображения с електронна микроскопия на BAM. BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/mL за двата хем протеина), бяха дехидратирани и разпръскване покрито със злато. Снимките са направени в увеличение 1000 × (скала = 50 µm) в центъра на тъканта и 2000 × увеличение (скала = 100 µm) от страната на тъканта.
Биохимичен анализ на секретирани протеини чрез BAMs. Средата за клетъчни култури от BAM, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина), се отстранява след 72 часа инкубация и се измерва за (A) азотен оксид (n = 5) и (B ) Съдържание на разтворими GAG (n = 6). * p ≤ 0,05.
Съдържание на пигмент и оцветяване на тъканите. (А) Общото съдържание на пигмент се определя количествено спектроскопски чрез хомогенизиране на BAMs, генерирани от BSC, BSC + Hb или BSC + Mb (3 mg/ml за двата хем протеина) и говеждо месо (n = 6 за всички групи) в натриев фосфатен буфер, което води до освобождаване на пигмент в разтвора. Количеството пигмент се изчислява от стандарт на Hb и Mb. (B) Показват се средни стойности на L * a * b * за BSC (n = 6), BSC + Hb (n = 5) и BSC + Mb (n = 6) и говеждо месо (n = 9). Говеждият цвят се представя като пресен или варен BAM цвят след инкубация от един ден или девет дни. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001.