Туморният некротичен фактор α е определящ фактор за патогенезата и прогресирането на заболяването при микобактериите

Съобщено от Маклин Маккарти, Университета Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк (получено за преглед на 12 януари 1999 г.)

определящ

Резюме

Туберкулозата на централната нервна система (ЦНС) е едно от най-сериозните прояви на заболяването. При децата туберкулозният менингит (ТБМ) се свързва с около 50% смъртност и повечето от оцелелите имат трайни неврологични последствия и изпитват значителни увреждания (1–4). Въпреки тежестта на клиничното представяне, клетъчните и молекулярните механизми, които са в основата на патогенезата на микобактериалната болест в ЦНС, са слабо разбрани.

По-рано докладвахме за заешки модел на експериментален TBM (5). Когато зайците бяха заразени с високи дози микобактерии в ЦНС, те се поддадоха на инфекцията в рамките на няколко дни. В този модел лечението на заразени зайци със стандартни противотуберкулозни антибиотици не предпазва животните от смърт, свързана с менингит. Въпреки това, комбинацията от противотуберкулозни лекарства с имуномодулиращото лекарство талидомид води до драстично подобрение на резултата и заразените зайци оцеляват. Благоприятният ефект на талидомид е свързан с инхибиране на производството на фактор туморна некроза α (TNF-α), намалена левкоцитоза в цереброспиналната течност (CSF) и отслабване на възпалителния отговор в менингите.

TNF-α е един от цитокините, участващи в защитния клетъчно-медииран имунен отговор на микобактериите (6). Освен защитната си роля, производството на TNF-α е свързано с развитието на патология in vivo, включително некроза на тъканите и кахексия (загуба) (7, 8). В ЦНС TNF-α участва в индуцирането на реакция на треска, активира оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза и задейства освобождаването на други цитокини (9-12). TNF-α може също да повлияе на транспорта на съединенията в мозъка, като „отвори“ кръвно-мозъчната бариера (BBB) ​​(10). При пациенти с бактериален менингит високите нива на TNF-α в ликвора корелират с повишени нива на IL-6 и протеини, както и ниски нива на глюкоза (13). В допълнение, нивата на TNF-α и IL-1β са свързани с продължителна треска, гърчове, спастичност и смърт (13–15).

За да проверим дали нивата на TNF-α в ликвора определят степента на патогенеза, заразихме зайци в ЦНС с различни щамове на Mycobacterium bovis, включително вирулентен M. bovis Ravenel и авирулентен M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG). Проследяват се постоянството на заразяващите организми, нивата на TNF-α, левкоцитозата и нивата на протеин в ликвора и се проследява клиничното протичане на инфекцията. За директна оценка на приноса на TNF-a към патогенезата, зайците са заразени с рекомбинантен щам на M. bovis BCG, който секретира миши TNF-α. Оценихме възпалителните параметри, прогресията на заболяването и мозъчната патология при тези зайци и ги сравнихме с контролните зайци, инокулирани с M. bovis BCG, носещи само плазмидния вектор.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Заразяване на организми.

Използваните щамове на M. bovis са: (i) M. bovis Ravenel (Trudeau Mycobacterial Culture Collection, TMC no.401), за които е известно, че са силно вирулентни при зайци (16, 17); (ii) M. bovis BCG Pasteur (Trudeau Mycobacterial Culture Collection, TMC № 1011), който е авирулентен при зайци; (iii) рекомбинантен щам на М. bovis BCG Монреал, генетично конструиран за секреция на миши TNF-α (BCG mTNF-α); и (iv) контролния щам на M. bovis BCG Montreal, носещ само плазмидния вектор [BCG Montreal (v)] (18). Генетичните манипулации на BCG не повлияват темповете на растеж: и двата щама [BCG mTNF-α и BCG Montreal (v)] показват подобен растеж в течност и в твърда среда. Също така двата щама показват сходни темпове на растеж в белите дробове след интравенозна инфекция на мишки B6x129 (L.-G. Bekker и G. Kaplan, непубликувани данни). Микобактериите са отглеждани в бульон Middlebrook 7H9 (Difco), последван от култура в среда Proskauer и Beck, съдържаща 0,01% Tween 80, както е описано (19). Рекомбинантните микобактерии се отглеждат както по-горе с 20 μg/ml канамицин (Sigma), както е описано (18). Микобактериите се съхраняват замразени в аликвотни части и след това се размразяват и се подлагат на кратка ултразвукова обработка, за да се разпаднат инертните материали. Крайните едноклетъчни суспензии бяха приготвени за постигане на инокулум от 5 × 10 5 или 2 × 10 7 образуващи колонии единици (cfu) на 0,1–0,2 ml.

Индукция на менингит.

Бяха използвани новозеландски бели зайци, ≈2,5 кг (развъдни лаборатории на Чарлз Ривър), както е описано (5). Анестезираните зайци бяха поставени в стереотаксична рамка, гръбначна игла беше въведена в цистерната magna за вземане на проби от CSF и интрацистернално бяха инжектирани 0,1–0,2 ml живи микобактерии или физиологичен разтвор без пироген (4–6 животни на експеримент). На 2 часа след инокулацията се получава проба от CSF, разрежда се и се поставя върху 7H10 агар, за да се определи броят на инжектираните cfu. В някои експерименти пробите от CSF бяха изтеглени на 0, 2, 4, 6 и 8 дни след инокулацията. В други експерименти пробите са получени на ден 0, 1, 3, 7, 14 и 21. След евтаназия половината мозък и сегмент на белия дроб, черния дроб и далака са събрани асептично, хомогенизирани и използвани за оценка на бациларното натоварване. Другата половина на мозъка и останалите органи бяха отстранени и фиксирани в 10% (обем/обем) буфериран формалин ацетат (Fisher) и подготвени за хистопатология. Този протокол е одобрен от Комитета по грижа и употреба на животните в университета Рокфелер.

В допълнение, рекомбинантен миши TNF-α (4 μg в 200 μl физиологичен разтвор; Endogen, Cambridge, MA) се инжектира в цистерната магна на зайци. Левкоцитозата се оценява на 0, 4, 6, 8, 10 и 24 часа, както е описано по-долу.

CSF проби.

Веднага след събирането, дублирани проби от CSF бяха анализирани за брой бели кръвни клетки (Coulter) и 100 μl CSF бяха отстранени за определяне на бактериалното натоварване. Остатъкът от CSF се центрофугира при 10 000 × g в продължение на 5 минути и супернатантата се съхранява при -70 ° C за TNF-a и протеинови анализи. Концентрацията на CSF протеин се определя чрез използване на метода на бицинхониновата киселина (BCA комплект, Pierce), както е описано от производителя. Клетъчната утайка се използва за диференциално броене на клетките (Diff-Quick, Baxter) и за електронна микроскопия.

Кръвни проби.

Кръв се събира в различни точки от ушната артерия с хепаринизирана спринцовка и се центрофугира при 10 000 × g. Плазмата се отделя и замразява при -70 ° С за оценка на TNF.

Анализ на TNF.

Тъй като понастоящем не е наличен TNF-α ELISA комплект за зайци, биологичната активност на TNF (TNF-α и TNF-β) в CSF и плазмата е изследвана чрез използване на миши фибробласти L929 като целеви клетки в анализ за цитотоксичност, както е описано (20). Минималното ниво на откриване е 16 единици/ml.

Определяне на нива на миши TNF-α.

Способността на рекомбинантните микобактерии да секретират миши TNF-a беше проверена чрез измерване на концентрацията на цитокин в супернатантите на бактериалната култура чрез ELISA (Endogen, Cambridge, MA). Нивата на миши TNF-a в заешки проби от CSF също се определят чрез ELISA.

cfu Анализ.

Бактериалните натоварвания в ликвора, мозъка, белите дробове, черния дроб и далака на заразените зайци се оценяват чрез нанасяне на 10-кратни серийни разреждания на ликвора и на хомогенатите на органи върху плочи от агар Middlebrook 7H10 (Difco), както и върху агар Middlebrook 7H10 допълнено с 20 μg/ml канамицин (Sigma). Плаките се инкубират при 37 ° С в продължение на 2-3 седмици. Колониите бяха преброени и изразени като cfu.

Хистопатология.

След фиксиране в 10% формалин (Fisher), пробите от органи се вграждат в парафин (TissuePrep 2, Fisher) и след това се разделят и оцветяват с хематоксилин и еозин и киселинно бързо оцветяване (Kinyouns). Мозъците бяха разрязани напречно на последователни 2 до 3-милиметрови участъци от рострален до каудален. Избрани са секции, представящи предния, средния и задния мозък.

Електронна микроскопия.

Клетъчната утайка на CSF и част от мозъка, включително менингите, са обработени за трансмисионна електронна микроскопия, както е описано (21). Секции бяха оцветени и изследвани с пропускателен електронен микроскоп JEM 100CX (JEOL).

Статистически анализ.

Резултатите са представени като средни стойности, получени за всички животни, оценени във всеки момент от времето. Данните бяха анализирани с помощта на независим тест на Student's t за сравняване на различните групи животни. P 5 cfu) или висока (2 × 10 7 cfu) доза предизвикват относително високи дозозависими нива на TNF в CSF, които достигат своя връх 2 часа след инфекцията (фиг. 1). Значителни нива са наблюдавани до ден 8 (данните не са показани). TNF също се открива системно в плазмата на зайци, заразени с високата доза Ravenel (данните не са показани). За разлика от това, зайци, инокулирани с BCG Pasteur, са имали по-ниски нива на TNF в ликвора на 2 h и едва забележими нива в по-късни моменти след постинфекция (фиг. 1). По всяко време не се открива TNF в плазмата на тези зайци. Зайци, заразени с BCG Montreal (v), са имали по-ниски нива (висока доза) или никакъв TNF в ликвора (ниска доза) дори при пик (2 часа). По този начин Ravenel индуцира повече TNF, отколкото щамовете BCG, които индуцират или по-ниски нива, или никакви.

Нива на TNF в CSF 2 часа след инфекцията. Зайците бяха инокулирани интрацистернално с висока (2 × 10 7 cfu) (сенчести ленти) или ниска (5 × 10 5 cfu) (кръстосани щрихи) доза микобактерии. Значително по-ниски нива на TNF се наблюдават при зайци, заразени с ниската доза на M. bovis BCG Montreal (v) в сравнение с M. bovis Ravenel (P = 0,02). Стойностите са средни стойности ± SEM на резултатите, получени от 4–6 зайци на група. * Означава статистическа значимост.

Значителни разлики също са наблюдавани в отговора на левкоцитите в CSF (фиг. 2). Ravenel индуцира високо натрупване на левкоцити, което постепенно се увеличава, което показва, че BBB е нарушен. На 6-ия ден броят на клетките достига> 11 000 клетки на mm 3 и> 15 000 клетки на mm 3 при зайци, заразени съответно с ниска доза и висока доза. За разлика от него, BCG Pasteur и Montreal (v) не успяват да предизвикат забележителна левкоцитоза по всяко време (фиг. 2). При всички зайци, изследването на диференциалния брой в ликвора разкри, че> 90% от клетките са мононуклеарни (моноцити и лимфоцити).

Брой на левкоцитите и cfu в CSF на заразени зайци. Зайците се инокулират интрацистернално с висока (попълнени символи) или ниска (отворени символи) доза или от M. bovis Ravenel, BCG Pasteur, или BCG Montreal (v). Левкоцитозата е намалена при зайци, заразени с BCG Pasteur и BCG Montreal (v) в сравнение с Ravenel на ден 4 (P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Микобактериални нива в органи на заразени зайци (ден 8)

Менингит след инфекция с различни щамове на M. bovis.

Възпалителните параметри и бактериалното натоварване корелират с клиничния ход на менингита. Зайци, заразени с високи дози Ravenel, развиват остър прогресиращ менингит с тежки неврологични признаци, включително сънливост или раздразнителност, загуба на координация, хемипареза или хемиплегия и оцеляват 4-8 дни. Ниските дози Ravenel предизвикват субакутен възпалителен отговор, което води до забавено начало, по-малко тежки симптоми и оцеляване от поне 8 дни. Животните, инокулирани с BCG Pasteur или Montreal (v), не развиват никакви симптоми и не показват клинични признаци на заболяване на ЦНС.

Отговор на зайци след инфекция на ЦНС с рекомбинантен BCG секретиращ миши TNF-α.

Резултатите, описани по-горе, предполагат, че пиковите нива на TNF-α при 2 h постинокулация определят патогенезата и хода на микобактериалната ЦНС инфекция. За да се обърнем директно към ролята на TNF-α, заразихме зайци с ниска доза (5 × 10 5 cfu) от рекомбинантен щам на BCG Montreal, който експресира мишия ген за TNF-α (BCG mTNF-α) или контролния щам BCG Монреал (v). Животните се наблюдават в продължение на 3 седмици.

За да се потвърди, че BCG mTNF-α секретират миши цитокин по време на инфекцията, микобактериалните колонии, възстановени от ликвора, се отглеждат в бульон 7H9, допълнен с 20 μg/ml канамицин в продължение на 5 дни, и супернатантите се тестват за TNF-α с помощта на ELISA. Концентрациите на TNF-α бяха в диапазона от 10 000–40 000 pg/ml през всички времеви точки, което показва, че рекомбинантният BCG произвежда миши TNF-α през целия експеримент.

Отговор на зайци, заразени с BCG mTNF-α. Зайците бяха заразени интрацистернално с 5 × 10 5 cfu BCG mTNF-α (попълнени символи) (n = 10) или BCG Montreal (v) (отворени символи) (n = 9) и наблюдавани в продължение на 21 дни. (Горна лява) Концентрация на TNF в CSF на заразени зайци. Нивата на TNF за 2 часа са по-високи при зайци, инокулирани с BCG mTNF-α в сравнение с BCG Montreal (v) (P 3), се наблюдава в CSF 24 часа след приложението на цитокини. Този резултат е подобен на резултатите, получени в предишно проучване върху ефектите на екзогенно прилаган заешки TNF-α (11). Нашата констатация показва, че зайците реагират на миши TNF-α.

След това изследвахме отговора на левкоцитите в ликвора. BCG Montreal (v) не предизвиква значителна левкоцитоза (Фиг. 3). Броят на клетките беше 3 през целия експеримент. За разлика от това, BCG mTNF-α индуцира обширен приток на левкоцити в ликвора. Високият брой на левкоцитите се запазва до 21 ден.

Друга характеристика, характерна за нараняването на BBB, е натрупването на протеин в ликвора. Зайците, инокулирани с BCG Montreal (v), са имали нива на CSF протеин в нормалните граници (Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

CFU в органи на заразени зайци (ден 21)

Хистопатология на мозъчните обвивки и мозъка на заразени зайци (21 дни). (А) Заек, заразен с BCG Монреал (v). Лек фокален възпалителен отговор се наблюдава в мозъчните обвивки (стрелки). Няма данни за увреждане на периваскуларната тъкан или левкоцитна инфилтрация в невропила. (B) Заек, заразен с BCG mTNF-α. Наблюдава се подчертано удебеляване на лептоменингите и разтягане на арахноидното пространство от голям брой възпалителни клетки (стрелки). Обърнете внимание на разширяване на периваскуларното възпаление до невропил. Секциите се оцветяват с хематоксилин и еозин. Увеличение × 25. Кръвоносните съдове са етикетирани V.

Електронни микрографии на клетъчната утайка на CSF (ден 14) (A и B) и менингите (ден 21) (C и D) на зайци, заразени с BCG mTNF-α (A и C) или контролират BCG Montreal (v) (B и D). (А) Клетъчна утайка от ликвора на заек, заразен с BCG mTNF-α. Наблюдават се едноядрени клетки, включително увеличени неправилни макрофаги (М) и лимфоцити (Ly). Обърнете внимание на микобактериите в плътна вакуола (стрелки) в цитоплазмата на паразитиран макрофаг. Увеличение × 3 600. (а) По-голямо увеличение на вакуолата, съдържаща микобактерии. Увеличаване × 20 000. (B) Клетъчна утайка от ликвора на заек, заразен с BCG Montreal (v). Наблюдават се кръгли лимфоцити (Ly) и моноцити (M). В тези клетки не са открити фагоцитирани микобактерии. Увеличение × 2900. (В) Менингите на заек, заразен с BCG mTNF-α. Показана е част от менингеалната област, съдържаща капилярен съд (V), с лимфоцити (Ly) и моноцити (M) в периваскуларното пространство. Обърнете внимание на мигриращ лимфоцит, пресичащ ендотелния монослой в горната част на микрографията. Увеличение × 2900. (D) Менингите на заек, заразен с BCG Montreal (v). Показан е менингеален съд (V). В периваскуларното пространство се наблюдават малко мигриращи макрофаги (М). Увеличение × 2200.

ДИСКУСИЯ

Експериментите, описани тук, показват, че TNF-a е определящ фактор за микобактериалната патогенност в ЦНС. Няколко доказателствени реда подкрепят това заключение. Когато зайците са заразени с микобактериален щам, който предизвиква високи нива на TNF-α в ликвора, те развиват тежък остър менингит и умират в рамките на няколко дни. Това не се наблюдава, когато зайците са заразени с щамове на микобактерии, които не предизвикват много освобождаване на TNF-α. Освен това по-рано показахме, че при заразените зайци инхибирането на производството на TNF-α чрез лечение с талидомид блокира развитието на менингит (5). И накрая, когато невирулентният щам е генетично конструиран, за да съдържа функционален ген за TNF-α, невирулентният щам става вирулентен. Тези резултати предполагат, че патогенността на микобактериите в ЦНС зависи поне отчасти от индукцията на TNF-a, което води до нарушаване на BBB и отключване на възпалителната каскада. Тези промени водят до мозъчен оток, цереброваскуларни промени и повишено вътречерепно налягане (22).

Производството на TNF-α в ЦНС може да бъде толкова вредно, защото засяга съдовия ендотел чрез индуциране на прокоагулантна активност (23), образуване на тромби и производство на азотен оксид синтаза (24-26), като по този начин причинява ендартериит. Запушването на големи или малки съдове са най-честата причина за парализа на черепните нерви, хемипареза и парализа. Освен това се съобщава, че инжектирането на рекомбинантен човешки TNF-α в цистерната magna на зайци води до остро намаляване на церебралното усвояване на кислород и продължително намаляване на мозъчния кръвен поток (24). Дори малки количества TNF-α могат да окажат вредно въздействие върху капилярите, които вече са сенсибилизирани от микобактериални продукти (27). Нашите морфологични проучвания върху мозъка и мозъчните обвивки на зайци, заразени с BCG mTNF-α, демонстрират директно увреждането на съдовата система от локалното производство на TNF-α (Фиг. 5 и 6).

Възможно е ефектите на TNF-α върху микобактериалните числа в заразената клетка да се медиират чрез регулиране на апоптозата. Наскоро съобщихме, че индуцирането на апоптоза на заразени с микобактерии макрофаги с ATP 4 - или H2O2 е свързано с убиване на вътреклетъчните бацили (21, 30). Понастоящем изследваме дали нивата на TNF-α определят степента на апоптоза на заразени с микобактерии човешки моноцити in vitro, както и дали модулираната с цитокини апоптоза е свързана с убиване на вътреклетъчни бацили в модела на заешката инфекция.

Благодарности

Благодарим на Вилхелмин Хелман за нейната експертна помощ при изследванията на електронната микроскопия, Джуди Адамс за подготовката на фигурите и Маргарит Нулти за секретарската помощ. Тази работа беше подкрепена отчасти от Celgene Corporation (Warren, NJ).